1. Einleitung
Zur Einschleusung von gentischer Information (DNA bzw. RNA) in eine Zellen gibt es viele Möglichkeiten (physikalische und biologische). Die meisten physikalischen Methoden sind entweder relativ uneffizient oder bewirken keinen dauerhaften Effekt.
Ein optimales, natürliches Vehikel zur Einschleusung von DNA in Zellen sind Viren, deren Lebensziel es ist, ihre genetische Information möglichst effizient und dauerhaft von einer Zelle in die nächste zu transportieren.
Es wurde und wird immer noch versucht, verschiedene Viren so umzuwandeln, daß sie statt ihrer eigenen genetischen Information die Information von therapeutischen Genen in die Zelle transportieren. Ein Virus, das sich in vieler Hinsicht sehr gut dafür eignet, ist das Retrovirus. Eine Besonderheit aller Retroviren ist, daß die genetische Information des Retrovirus stabil in das Genom der Wirtszelle integriert und damit auf alle Tochterzellen vererbt wird. Gerade diese Eigenschaft, die Voraussetzung für einen dauerhaften Effekt ist, macht die Retroviren für einen Einsatz als Gentransfer-Vehikel (Vektoren) sehr attraktiv.
Damit das Retrovirus die neue therapeutische Information in die Zelle transportiert, muß diese vorher in das retrovirale Genom eingefügt werden. Da durch diese zusätzliche DNA bzw. RNA die maximale Kapazität des Retrovirus überschritten wird, muß ein Teil der ursprünglichen Virus-DNA bzw. RNA entfernt werden. Das hat den Vorteil, daß ein derart modifiziertes Virus (rekombinantes Virus bzw. Retroviraler Vektor) nicht mehr vermehrungsfähig und damit nicht mehr virulent ist. Allerdings braucht ein Retroviraler Vektor bestimmte retrovirale Proteine, um überhaupt Zellen infizieren zu können. Diese Proteine werden von sogenannten Verpackungszellinien kontinuierlich hergestellt. Diese produzieren, vereinfacht gesagt, ständig ‘leere' retrovirale Hüllen, die keine retrovirale RNA enthalten.
In diese Verpackungszellinien wird nun zusätzlich die genetische Information der rekombinanten Retroviren eingeschleust. Diese kann nun in die leeren retroviralen Hüllen verpackt werden und man erhält einen kompletten Retroviralen Vektor, der anstelle der viralen RNA nun die genetische Information des therapeutischen Gens trägt. Dieser retrovirale Vektor kann Zellen infizieren und diese Zellen entweder abtöten (Gentherapie für Krebs oder Viruskrankheiten) oder ein nicht vorhandenes Gen ersetzen (Therapie von Gendefekten).
Im Rahmen dieser Übung soll der Überstand einer solchen Verpackungszellinie benutzt werden, um Zielzellen (NIH3T3) zu infizieren. In diesem Versuch enthält der retrovirale Vektor kein therapeutisches Gen sondern ein Reportergen, das green fluorescent protein (GFP)-Gen, das bereits im Transfektionsversuch beschrieben wurde.
2. Versuchsdurchführung
Die für den Versuch benötigten Virus-produzierenden Verpackungszellinien und Zielzellen wurden am Vortag in der richtigen Konzentration ausgesät.
a. Entfernen des Mediums von den Zielzellen (5x105 NIH3T3)
b. Aufsaugen von 3 ml Überstand (enthält den retroviralen Vektor) von den Verpackungszellinien in eine Spritze
c. Aufschrauben eines sterilen 0,45 µm Filters auf die Spritze (uim zu verhindern, daß Verpackungszellen transferiert werden => falsch positives Ergebnis)
d. Hindurchdrücken des Überstandes durch den Filter auf die Zielzellen
e. Hinzupipettieren von 2µl Polybrene (8 mg/ml)
f. Gleichmäßiges Verteilen des Überstandes durch leichte Bewegungen in Nord-Süd bzw. West-Ost Richtung
g. 6 Stunden Inkubation bei 37oC
h. Hinzupipettieren von 6 ml Normalmedium
Überprüfung der Infektionseffizienz am Fluoreszenzmikroskop