Einleitung
Antigen-Antikörper-Reaktionen können durch Markierung einer Komponente mit Enzym sichtbar gemacht werden, indem die Enzymaktivität mit Hilfe einer Farbreaktion gemessen wird. Der Enzym-Immun-Test findet vielseitig Anwendung als schnelle Routinemethode in der klinischen Chemie und Pharmakologie, in der Mikrobiologie, Virologie und im Blutspendewesen.
Beim ELISA finden zwei Reaktionen statt: die immunologische und die enzymatische und diesbezüglich werden die Teste in homogene und heterogene untergliedert.
Für die Bestimmung von Antigenen und Haptenen wird der Begriff Enzymimmunoassay (EIA) und für die Antikörperbestimmung wird der Begriff Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet.
Die EIA-Techniken werden auch in kompetitive (Serum -AK versus monoklonale Test -AK`s) und nichtkompetitive (z. B. indirekter EIA) unterteilt. Die nichtkompetitiven EIAs (Festphasenassays) werden auf Grund ihres Reaktionsaufbaus als Sandwich-Teste bezeichnet.
FeLV-ELISA-Prinzip
Der FeLV-ELISA ist ein Beispiel für nichtkompetitive Sandwich- Technik. Das Feline Leukämievirus (FeLV) ist ein übertragbares, onkogenes ss-RNA-Virus, das einen immunsuppressiven Effekt und eine erhöhte Anfälligkeit für vielfältige sekundäre Erkrankungen hervorruft. Das Blut FeLV-infizierter Katzen enthält hohe Konzentrationen des gruppenspezifischen Antigens p27. Die Reaktionsvertiefungen (wells) der Mikrotiterplatten sind mit Anti-FeLV-Antikörpern beschichtet (stationäre Phase), die gegen einen bestimmten Abschnitt des FeLV-Antigens p27 gerichtet sind. Durch monoklonale Antikörper, die mit dem Enzym Peroxidase markiert sind (Konjugat), wird ebenfalls hochspezifisch eine andere Determinante des p27 erkannt. Der Reaktionsansatz, bestehend aus der stationären Phase, aus der zu untersuchenden Probe und den markierten Antikörpern wird inkubiert. Enhält das Untersuchungsmaterial p27-Antigen, so wird dieses an die AK´s in den Vertiefungen fixiert. Gleichzeitig erfolgt an einer anderen Stelle des Antigens die Bindung der enzymmarkierten Antikörper. Nichtgebundene, überschüssige, markierte Antikörper werden nun durch waschen entfernt. Anschließend wird ein Farbindikator (Substrat) zugegeben.
Eine Blaufärbung im Reaktionsansatz zeigt das Vorhandensein des FeLV-Antigens an. Enthält das Untersuchungsmaterial kein FeLV p27-Antigen, bleibt die entsprechende Farbreaktion aus.
Testdurchführung
1. Die benötigte Anzahl an Reaktionswells wird entnommen (Positiv- und Negativkontrolle, Diagnostikproben).
2. In die jeweilige Vertiefung wird 50 µl der Probe, der Positivkontrolle und der Negativkontrolle gegeben. Für jede zu untersuchende Probe wird eine neue Pipette verwendet.
3. In jede der Vertiefungen wird 50 µl Konjugat gegeben. Die Reagentien werden durch leichtes Klopfen gemischt. Der Reaktionsansatz wird 5 Min. bei Zimmertemperatur inkubiert.
4. Anschließend werden alle wells entleert.
5. Die Reaktionsvertiefungen werden mit destilliertem Wasser 5-mal gewaschen.
6. In alle wells werden zuerst 50 µl Farbindikator und gleich anschließend jeweils 50 µl Pufferlösung gegeben. Der Testansatz wird 5 Min. inkubiert und danach ausgewertet.