Forschung
Virus-Epidemiologie und -Phylogenie, Zoonosen
Die Verfügbarkeit mannigfaltigen Untersuchungsmaterials aus dem normalen Diagnosebetrieb des Instituts sowie von den vielen assoziierten Labors in Europa hat es erlaubt, die Verbreitung mehrerer Viren in Detail zu untersuchen. Die Epidemiologie von felinen und caninen Coronaviren wird unter zuhilfenahme traditioneller sowie molekularbiologischer Identifizierungsmethoden ausgeführt. Auch werden verschiedene Antigene des caninen Parvoviruses identifiziert.
Die Polymerase Chain Reaction (PCR) und das anschließende Sequenzieren des amplifizierten Produkts ermöglichte es, die auf der Nukleinsäure basierende Epidemiologie und Phylogenie einer ganzen Reihe verschiedener Viren, wie z.B. des equinen Artheritisvirus, des 'feline immunodeficiency virus' (FIV) und von 4 Fischviren, zu erstellen.
Die Isolierung neuer Viren und enge Kollaborationen mit Tiermedizinern und Pathologen stellten sich als wichtig für die Etablierung und Charakterisierung neuer pathogener Isolate heraus.
Von besonderem Interesse sind die potentiell zoonotischen Viren (Viren, die von Tier auf Mensch übertragen werden und dort krankheitserregend sind), wie z.B. Encephalomyocarditis-Virus, Borna-Virus und Hanta-Virus. Die vielen guten Beziehungen zu human- und veterinärmedizinischen Institutionen in der ganzen Welt sind von großer Bedeutung für diese Untersuchungen. Zusammenhänge zwischen menschlichen Krankheiten und diesen Viren lassen sich aus dem Verstehen der Virusverbreitung verschiedener Virustypen unter den Tieren sowie in menschlichen Proben ableiten. Das Erkennen dieser Zusammenhänge erlaubt das Anwenden neuartiger Strategien der Krankheitskontrolle, um das Ausbreiten dieser aufkommenden Viren in der Humanpopulation zu unterbinden.
Regulierung und Wirt-Virus Beziehung
Die Grundlagenforschung am Institut beschäftigt sich intensiv mit der Regulierung und der Wirt-Virus Beziehungen von Retroviren. In der Welt der Viren haben Retroviren eine einmalige Position. Retroviren besitzen ein RNA-Genom, das nach der Infektion der Zelle in doppelsträngige DNA umgewandelt wird. Dieses virale Genom wird dann in das Genom der Zelle eingebaut und erhält die Eigenschaften zellulärer Gene. Das integrierte retrovirale Genom wird fester Bestandteil der zellulären genetischen Information und kann nur durch den Zelltod verloren gehen. Sollte die Integration in einer Keimzelle (Zellen des Reproduktionssystems) erfolgen, dann wird das virale Genom als Teil des Wirtszellengenoms an die Tochterzellen vererbt. Virale RNA-Transkripte und Proteine werden durch die Expression des integrierten viralen Genoms synthetisiert und können sich zu neuen Retroviren vereinigen. Diese Viren knospen (bud) von der Wirtszelle, ohne diese zu beschädigen. Solche retroviral infizierten Zellen könnten prinzipiell als 'Virusfabriken', die permanent neue Viren herstellen, bezeichnet werden.
Am Institut werden funktionelle Domänen des Gens für die Integrase, die an der Integration des Murine Leukaemia Virus (MLV) in das Wirtsgenom beteiligt ist, untersucht. Veränderungen an diesem Gen sollten es ermöglichen, das Gen außerhalb des zellulären Genoms (episomal) zu halten, und damit die Vererbung an Tochterzellen zu unterbinden.
Die Mechanismen der Regulierung der viralen Genexpression des Mammary Tumour Virus (MMTV) werden ebenfalls am Institut studiert. Dieses Retrovirus besitzt mindestens vier Promotoren (Ansatzpunkte für die virale Genexpression), die alle individuell reguliert werden. Eines der viralen Gene ist ein trans-regulierender Faktor (naf), der die Expression anderer viraler Promotoren sogar auf anderen DNA-Molekülen vermindern kann. Das Verstehen dieses Regulationsmechanismus könnte hilfreich für die Entdeckung sein, wofür das Virus diesen Faktor in seinem Lebenszyklus benötigt.
Ein weiteres exprimiertes Gen dieses Virus ist ein Superantigen, das ganze Klassen von T-Zellen zur Teilung anregt, diese dann aber 'lahm legt'. Dieser Vorgang hat signifikanten Einfluß auf das Immunsystem und scheint im Zusammenhang mit der Infektionsroute des Virus im Körper zu stehen, die vom Darm (wo das Virus in der Muttermilch angeliefert wird) zu den Brustdrüsen führt, (wo das Virus wieder über die Milch abgegeben wird). Nicht nur die Regulierung dieser beiden Genprodukte wird am Institut in Zellkultur und in Mäusen untersucht, sondern auch der genaue Mechanismus, der die Virusübertragung vom Darm zur Brustdrüse ermöglicht.
Das Verständnis für die Mechanismen der Genregulierung und der Virusübertragung wird es uns ermöglichen, MMTV als einen viralen Vektor nachzubilden, der therapeutische Gene übertragen könnte. Die Tatsache, daß dieses Virus mittels Zellen des Immunsystems auf die Brustdrüse übertragen wird, eröffnet Möglichkeiten, therapeutische Gene in Immunzellen und in das Brustdrüsengewebe einzubringen und so zahlreiche Erkrankungen des Immunsystems, sowie Brustkrebs zu behandeln.
Infektionen durch Retroviren werden durch das Zusammenspiel von Oberflächenproteinen (Envelope) und Zellstrukturen (Rezeptoren) bestimmt. Nur dann, wenn der Envelope mit dem korrekten Rezeptor zusammenwirkt, kann das Virus die Zelle infizieren. Veränderungen am Envelope machen es möglich das Infektionsspektrum des Virus zu beeinflussen. Am Institut wird daran gearbeitet, das Infektionsspektrum des MLV durch das Ersetzen des Envelopes mit dem des MMTV zu verändern. Der Zusatz von Teilen des MLV-Envelopes zu dem übertragenen MMTV enevelope erhöht die Infektionseffizienz dieser Hybridvektoren. So könnten Viren mit neuen Infektionsspektren hergestellt werden, die wiederum für die gezielte Anlieferung therapeutischer Gene benutzt werden könnten.
Virale Vektoren
Konstruktion neuer Vektoren
Über die Jahre haben sich Viren zu perfekten Systemen entwickelt, um ihre genetische Information in die von ihnen infizierten Zellen zu übertragen. In diesem Zusammenhang sind Retroviren von besonderem Interesse, da diese ihre genetische Information in das Genom der Wirtszelle integrieren. Dort wird das virale Genom wie jedes andere Gen behandelt, exprimiert und an Tochterzellen vererbt. Auch führen retrovirale Infektionen der Wirtszelle keinen Schaden zu. Würde es möglich sein, dem Virus andere Fremdgene 'unterzuschieben', dann würden diese Viren ein ideales Transportmittel für die Integration dieser Gene in das Genom der infizierten Zelle darstellen. Viren, die solche anderen Fremdgene tragen, werden Vektoren genannt. Die Herstellung eines Vektors ist fast immer mit dem Ersetzen viraler Gene durch die Fremdgene verbunden. Die resultierenden Vektoren sind nicht in der Lage zu replizieren, da einige der hierfür notwendigen Gene durch diese Fremdgene ersetzt wurden. Die so fehlenden Genprodukte können von Genen exprimiert werden, die sich auf anderen Genkonstrukten befinden (in trans). Zellen, die diese fehlenden Gene in trans exprimieren, werden 'packaging cells' genannt und ermöglichen die Produktion infektiöser retroviraler Vektoren.
Ein Hauptaugenmerk der Institutsforschung liegt auf der Herstellung retroviraler Vektoren, die eine regulierte Expression der therapeutischen Fremdgene erlauben. Diese Regulation kann absolut sein (ReCon-Vektor). Diese alles-oder-nichts Steuerung erlaubt die auf die Zielzelle begrenzte Expression therapeutischer Gene. Diese Regulation kann aber auch gewebespezifisch sein, dadurch daß bestimmte Viren gewebespezifische Regulationselemente besitzen (ProCon). Dies erlaubt die auf Zielgewebe oder Tumor begrenzte Expression therapeutischer Gene.
Für eine effiziente Infektion der Zielzellen sind normale Retroviren auf Zellteilung angewiesen. Teilungsinaktive Zellen, wie z.B. Gehirnzellen, können nicht infiziert werden. Jedoch gibt es spezifische Typen von Retroviren (Lentiviren, wie das Human Immunodeficiency Virus, HIV), die Strategien entwickelt haben, um diese Einschränkung zu umgehen. Anstatt retrovirale Vektoren auf der Basis von HIV zu entwickeln, beschäftigt sich das Institut damit, diesen Mechanismus, der die Infektion inaktiver Zellen erlaubt, in normale MLV-Vektoren einzubauen.
Schließlich werden am Institut eine neue Generation von Vektoren entwickelt, die eine effizientere in vivo Infektion ermöglichen. Die Verwendung retroviraler Vektoren für die Gentherapie solider Tumore hängt von der Fähigkeit dieser Vektoren ab, Metastasen im gesamten Körper zu erkennen und zu zerstören. Diese Zerstörung kann nur erfolgen, wenn der Vektor mit hoher Effizienz die Metastasen erreicht. Da existierende Vektoren zu ineffizient sind, werden neue Strategien benötigt. Das allgemeine Verstehen der Virusbiologie und des viralen Lebenszyklus kann hier wertvolle Hinweise für die Verbesserung existierender Vektorsysteme liefern.
Gentherapie
Brustkrebs
Das Mammakarzinom ist eine der häufigsten Tumorarten bei Frauen und die Todesursache Nummer eins in der weiblichen Bevölkerung im Alter von 40 - 50 Jahren. Trotz großer Fortschritte in der Behandlung kehrt der Tumor nach der Entfernung oft zurück. Zusätzlich wirken Chemo- und Strahlentherapie oft nicht auf Metastasen. Der jährliche Anstieg der Brustkrebsrate um 3 - 4% verdeutlicht die Notwendigkeit für neue Therapiestrategien. Um erfolgreich zu sein, muß eine solche Therapie auch Metastasen erfassen.
Am Institut wird an einer retroviralen Gentherapie gearbeitet, die es erlaubt, therapeutische Gene in die Zellen der Patienten zu integrieren. Die Expression dieser Gene wird dann ausschließlich in den Brusttumoren und Metastasen erfolgen.
Für diese Zielsetzung wurden die regulatorischen Regionen des whey acidic protein (WAP)- Gens, des -S1-Casein-Gens, und der Promoter des MMTV ausgewählt. Das WAP-Gen wird normalerweise nur in der Brustdrüse laktierender Nager exprimiert; eine Synthese von -S1-Casein wurde bisher nur in milchproduzierenden Brustdrüsen verschiedener Säugerspezies (unter anderem auch im Menschen) beobachtet; der MMTV-Promoter ist nur in der Brustdrüse und der Milz weiblicher Mäuse aktiv.
Zellkulturen sowie transgene Mäuse werden verwendet, um die regulatorischen Elemente zu identifizieren, die zu der brustdrüsenspezifischen Expression beitragen. Da die Expression milchspezifischer Gene in einschichtigen Zellkulturen schwierig ist, wurden am Institut verschiedene 3-dimensionale Matrixsysteme entwickelt, die es erlauben, die gewebespezifischen Promotorelemete im Detail zu charakterisieren. Transgene Tiermodelle ermöglichen es die Spezifität der in vitro identifizierten Elemente zu bewerten. Transgene Mäuse enthalten das an ein Reportergen gebundene regulatorische Element in allen Zellen und ermöglichen so eine einfache Untersuchung der Expression und deren Limitierung auf das gewünschte Gewebe. Im vorliegenden Fall wäre dies das Brustdrüsengewebe.
Nachdem die relevanten brustspezifischen Elemente charakterisiert wurden, werden sie in unseren ProCon-Vektor inseriert und für vorklinische Tests verwendet. Das anschließend synthetisierte Protein kann dann in diesen Zellen ein vorab appliziertes Medikament in dessen toxische Form überführen, was letztendlich in der spezifischen Abtötung der Tumorzellen resultiert.
Murine und humane Brustkrebsmodelle stehen im Institut zur Verfügung. Nach der Behandlung mit dem brustdrüsenspezifischen ProCon Vektor, der entweder Marker- oder therapeutische Gene trägt, wird die Effizienz einer Behandlung an Mäusen, die entweder spontane Brusttumore entwickeln, oder aber an Mäusen, denen syngene (vom selben genetischen Hintergrund) Zellen injiziert wurden und die anschließend Brustdrüsenkrebs entwickeln, bewertet.
Humanes Brusttumorgewebe wird aus Krankenhäusern bezogen und in SCID-Mäuse eingebracht. Diese Mäuse zeichnen sich durch das Fehlen des Immunsystems aus und stoßen daher diese transplantierten Zellen nicht ab. In diesem Modell für humanen Brustkrebs kann der Anwendungsnutzen des oben beschriebenen Ansatzes direkt bewertet werden.
Klinische Versuche werden momentan an Hunden mit Brustkrebs sowie an Menschen mit wiederkehrendem, unheilbaren Brustkarzinom durchgeführt.
Gentherapie
Bauchspeicheldrüsenkrebs
Jährlich erkranken 60,000 Menschen an Krebs der Bauchspeicheldrüse. Abgesehen von einem chirugischen Entfernen der Drüse bietet der heutige Stand der Medizin keine Möglichkeit der Behandlung, Da die Diagnose dieses Krebs meistens sehr spät erfolgt, ist das Entfernen des Primärtumors nur noch für wenige Patienten sinnvoll. Zur Zeit leben nur 10% aller Patienten länger als 1 Jahr nach der Diagnose, die meisten sterben innerhalb einiger Monate.
Obwohl die Tumorzellen das Hauptangriffsziel für das Medikament sind, werden auch andere sich teilende Zellen, wie die des Blutsystems betroffen. Ifosfamid ist ein Zytostatikum, das bereits seit mehr als zehn Jahren bei der Behandlung von Tumoren zur Anwendung kommt. Die Droge wird in der Regel in einer inerten Form intravenös verabreicht und verbreitet sich im ganzen Körper. In der Leber wird sie durch das nur dort aktive Enzyme Zytochrom P450 2B1 aktiviert und erlangt dadurch ihre antitumorgene Wirkung. Die aktive Droge verbreitet sich im ganzen Körper, wobei sie die sich teilenden Zellen abtötet.
Um die damit verbundenen Nebenwirkungen so gering wie möglich zu halten, soll mit Hilfe der Gentherapie die Aktivierung des Ifosfamid von der Leber direkt in den Tumor verlegt werden. Durch die damit verbundene Konzentration der aktiven Droge im Tumor ist eine bessere therapeutische Wirkung mit geringeren Nebenwirkungen zu erwarten. Im ersten Schritt werden dazu Zellen, die das Zytochrom P450 2B1 (CYP2B1) Gen exprimieren, in den Tumor implantiert. Diese Zellen sind somit in der Lage, Ifosfamid zu aktivieren und die aktive Form in den umgebenden Tumor abzugeben. Ausgedehnte Experimente in vitro und in vivo haben gezeigt, daß diese Methode ein nicht unerhebliches therapeutisches Potential besitzt. Um diese implantierten Zellen vor der Abstoßungsreaktion des Immunsystems zu schützen, werden sie in ein Polymer von Zellulosesulfat, das vom Immunsystem nicht als fremd erkannt wird, eingeschlossen.
Zahlreiche Experimente in vitro und in vivo bestätigten das beachtliche therapeutische Potential dieser Methode. Als Reaktion auf diese Ergebnisse wurden klinische Versuche beim Menschen mit eingekapselten, CYP2B1 exprimierenden Zellen begonnen. Bei diesen Versuchen werden eingekapselte Zellen intraarteriell unter zuhilfenahme eines Katheters und unter lokaler Anästhesie in den Tumor eingebracht. Die Verabreichung des Ifosfamids erfolgt anschließen systemisch.
Um die Effizienz des Systems zu verbessern und auch um das Behandeln von Metastasen zu ermöglichen, werden am Institut gewebespezifische regulatorische Elemente für die tumor- oder bauchspeicheldrüsenspezifische Expression von Genen in Tiermodellen und in Zellkultur bewertet. Diese Elemente beinhalten unter anderem die Promotoren der Carbonische Anhydrase und Tissue Factor Gene.
Vielversprechende regulatorische Elemente werden in den ProCon-Vektor eingeführt und in vorklinischen Tiermodellen bewertet. Sowohl murine als auch syngenische Rattenmodelle des Bauchspeicheldrüsenkrebs sind entweder am Institut oder bei assoziierten Laboratorien etabliert worden. Zellen humaner Pankreastumorlinien können in SCID Mäuse injiziert werden, wo sie dem Bauchspeicheldrüsenkrebs ähnliche Tumore hervorrufen.
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