Reverse Transkriptase Onkoviren
Retroviren haben eine lange Geschichte, obwohl erst 1981 der erste humane Retrovirus gefunden wurde.
1904 gelingt es Ellermann und Bang Geflügelleukose mit zellfreiem Gewebefiltrat auf Hühner zu übertragen und damit als infektiöse Krankheit einzustufen.
1905 stellt Paul Ehrlich seine Theorie der Immunkontrolle vor: Tumorzellen bilden sich oft im Organismus, aber das Immunsystem eliminiert sie schnell.
1911 überträgt Peyton Rous Hühnertumoren durch Gewebeverpflanzung; ihm gelingt auch die Isolierung des Infektionserregers (RSV).
1960 schlägt Howard Temin vor, daß Retroviren eine "Reverse Transkriptase" haben, da sie als RNA-Viren durch Aktinomycin D gehemmt werden.
1969 veröffentlichen Huebner und Todaro die "Virale-Onkogen"-Hypothese; =Übertragung von genetischer Tumorinformation und nicht pathologischer Reaktion auf ein Virus.
1981: Das Human T-cell-Leukämie-Virus wird gefunden.
1983: Human immunodeficiency virus gefunden.
Die meisten Retroviren infizieren Vertebraten, aber sie sind bei allen Lebewesen zu finden.
| Genus | Subgenus | Example Virus | Typ |
| Mammalian type B | Mouse mammary tumor MMTV sheep pulmonary adenomatosis |
exo-/endogen | |
| Mammalian type C | Mammalian "C" | Murine leukemia virus Felines Leukämie virus FeLV Simian Sarkom virus |
exogen exogen exogen |
| Reptilian "C" | Viper retrovirus | ||
| Reticuloendothelio- sis virus |
Reticuloendotheliosis virus | ||
| Avian Type C | Avian leucosis virus ALV Rous-Sarkom virus RSV avian Erythroblastosis virus avian Myoblastosis virus |
exogen exogen exogen exogen |
|
| Type D retrovirus | Mason-Pfizer monkey virus | exogen | |
| BLV-HTLV | Bovine leukemia virus BLV hum. T-cell Leukämie viren |
exogen endogen |
|
| Lentivirus | bovine lenti virus | bovine immuno-deficiency virus BIV |
exogen |
| equine lenti virus | Equine infectious anemia virus EIAV |
exogen | |
| feline lenti virus | feline immuno-deficiency virus FIV |
exogen | |
| ovine/caprine lentivirus |
caprine arthritis- encephalitis virus CAEV visna/maedi virus |
exogen
exogen |
|
| Primate lenti virus | HIV 1 HIV 2 simian immuno-deficiency virus |
exogen | |
| Spumavirus | human spuma virus | exogen |
Die Typisierung in endo-/exogen bezieht sich auf die Tatsache, daß die mit exogen bezeichneten Retroviren wie andere Viren durch Infektion weitergegeben werden. Endogene Retroviren sind in der Wirtskeimbahn schon integriert, sind oft inaktiv, können aber wieder aktiviert werden.
Früher wurden die Retroviren nach Morphologie in E.M.-Abbildungen eingeteilt.
Die HTLV/BLV Gruppe
Die Lentiviren: dreieckiges Core, Immunodefiziensviren, CAEV, Visna.
Die Spumaviren: die infizierten Zellen bilden vieleVakuolen.
Retroviren sind behüllte Partikel mit ca. 100 nm Durchmesser. Die Hülle trägt vom Virus codierte spikes:
In der Membran steckt das amorphe Matrixprotein (MA), das das Capsid überlagert. Das ikosaedrisch bis konisch geformte Capsid besteht aus dem Capsidprotein CA, in dem sich das core mit verschiedenen core-Proteinen (NC, RT, In) und das RNA-Genom befinden.
Tabelle der Retrovirusproteine
1.) Gruppenspezifische Antigene (Gag-Proteine)
Gag-Vorläuferproteine werden durch virale Proteasen in diese verschiedenen Proteine gespalten, die man in freigesetzten infektiösen Viruspartikeln findet. Die sequenzielle Anordnung der Gag-Proteine im Vorläuferprotein stimmt bei allen Retroviren überein.
Die Gag-Proteine haben mehrere Bedeutungen für das Virus:
Gag-Proteine induzieren die spezifische Immunantworten auf humoraler wie auch zellulärer Basis, was auf den hohen Gehalt konservierter Aminosäuren zurückzuführen ist. Ak's sind häufig typübergreifend, CTL's sind bei HIV gegen MA und CA beschrieben und kontrollieren die Infektion für einige Zeit.
2.) Enzyme
Die Protease, Reverse Transkriptase und die Integrase der Retroviren sind ebenfalls im Gag/Pol-Bereich der Pro-Virus-DNA codiert.
Die Protease spaltet in den ausgeschleusten Viren die Gag- und Gag/Pol-Vorläuferproteine in die Komponenten, die man in infektiösen Viruspartikeln vorfindet.
Die Reverse Transkriptase hat RNA- wie auch DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Zusätzlich funktioniert sie noch als Rnase-H, die die RNA von DNA/RNA-Hybriddoppelsträngen abbaut. Dieses Enzym hat keine Mechanismen zur Kontrolle der Lesegenauigkeit, was zu einer großen Anzahl falsch eingebauter Basen bei der Neusynthese führt. Dies wird auch medizinisch ausgenutzt, wobei (applizierte) Nucleotid-Analoga in die DNA-Stränge eingebaut werden und bei der Proteinsynthese dann zum Abbruch führen.
Die Integrase wirkt als Endonuclease (schneidet doppelsträngige DNA) so wie als Ligase. Mit dieser Aktivität integriert sie die Virus-DNA ins Wirtsgenom.
3.) Membranproteine (env)
Die Envelope-Gene codieren für Glycoproteine, die in der Cytoplasmamembran infizierter Zellen und qua de causa auch in der Virushülle integriert sind.
Aus einem Vorläuferprodukt gehen das externe (EP) und transmembrane (TP) Protein durch Spaltung im ER (und Golgi) hervor.
EP, auch SU oder gp120 genannt, ist für die Adsorption des Virus zuständig. Bei HIV sind dies die CD-4 Proteine der T-helper-cells.
Gegen die gp120 werden neutralisiernde AK's gebildet. Aufgrund der Anzahl variabler Bereiche im gp120 Genom ergeben sich eine große Anzahl verschiedener Isolate.
TP ist für die Fusion Virus/Cytoplasmamembran bzw. zwischen 2 CD-4 Zellen zuständig.
Anlagerung und Aufnahme
Retroviren sind umhüllte Viren mit einem Durchmesser von 80 - 120nm.
Aufbau des Genoms
Das Retrovirusgenom im Virus besteht aus 2 RNA-Molekülen, einzelsträngig und positivstrangorientiert, die am 5' Ende eine Cap haben und am 3' Ende polyadenyliert sind, wie eucariote m-RNA also. Die Länge variiert zwischen 8 - 11 kB.
Das Genom hat einige Besonderheiten:
Die Hülle entsteht aus der Zellmembran der virusproduzierenden Zelle und enthält zusätzlich das virale Hüllprotein (Env, envelope), das aus einem Transmembranprotein (TM) und einem an der Außenseite der Virushülle an das TM-Protein gekoppelten Oberflächenprotein (SU, surface) besteht. Letzteres interagiert spezifisch mit dem Virusrezeptor an der Oberfläche der Zielzelle und vermittelt die Aufnahme.
Die An- bzw. Abwesenheit eines geeigneten Rezeptors auf der Zielzelle legt fest, ob die Zelle von einem bestimmten Virus befallen werden kann oder nicht. Die Rezeptoren, die von Retroviren für die Aufnahme in die Zelle verwendet werden, sind normale zelluläre Proteine, die für den normalen Haushalt der Zelle nötig sind. Bisher sind nur wenige dieser Proteine, die eine Bedeutung als virale Rezeptoren haben, identifiziert worden. Das am häufigsten für die Konstruktion retroviraler Vektoren verwendete Retrovirus ist das murine Leukämievirus (MLV). Die Rezeptoren für zwei verschiedene Formen des MLV-SU-Proteins sind bereits bekannt. Das ecotropische SU-Protein interagiert mit einem Aminosäure-Transporterprotein auf der Oberfläche der Zielzelle. Dieses Protein wird nur von Mäusezellen exprimiert und limitiert daher das Infektionsspektrum von MLV auf Zellen murinen Ursprungs. Im Gegensatz hierzu interagiert das amphotropische SU-Protein mit einem verbreiteten zellulären Phosphat-Transporterprotein und erlaubt auch die Infektion von nicht-murinen Zellen.
Nach der spezifischen Interaktion der SU-Proteine mit den zellulären Rezeptoren werden zwei verschiedene Aufnahmemechanismen vermutet: entweder eine zelluläre Aufnahme durch Mikropinocytose im Vesikel, gefolgt von einer Fusion (zum Beispiel beim ecotropischen MLV) oder durch direkte Fusion der Virushülle mit der Zellmembran. Für letzteres ist das am besten untersuchte Beispiel das humane Immundefizienzvirus (HIV). Hier wird die Fusion durch eine Konformationsänderung im TM-Protein ausgelöst, wodurch eine vorher versteckte Fusionsdomäne vom Virus präsentiert wird. Nach der Fusion wird die Virushülle abgebaut (uncoating) und der Viruskern (core) in das Cytoplasma der Zielzelle freigesetzt. Der core ist aus dem Capsidprotein (CA) aufgebaut und umschließt den, der aus zwei identischen Kopien des viralen RNA-Genoms und dem Gag-Nucleocapsidprotein (NC) zusammengesetzt ist. Andere virale Enzyme sind im Virion auch mit dem NC-RNA-Komplex assoziiert.
Reverse Transkription und Kerneintritt
Konformationsänderungen im Core, die nach dessen Freisetzung ins Cytoplasma stattfinden, aktivieren die RT, die die doppelsträngige DNA-Kopie der viralen RNA synthetisieren. Bei diesem Prozeß werden einmalige Sequenzen, die an jedem Ende der viralen RNA liegen, verdoppelt und an beide Enden der neusynthetisierten DNA angehängt. Hierdurch entstehen an jedem Ende die langen terminalen Wiederholungen (long terminal repeat, LTR).
Reverse Transkription
Die virale RNA liegt im Nucleocapsid inclusive der t-RNA vor, die gleichzeitig den Primer bildet.
![[Image]](pict0.jpg)
PBS: Primer binding site
U5: Unic at 5' end
U3: Unic at 3' end
R: Repeat
Die Reverse Transkriptase steuert die Elongation am 5' Ende.
First Jump
Die bis zum Repeat verlängerte "First-Strand-DNA" setzt nach der Ringbildung mit der Synthese am Repeat des 3' Endes fort,
worauf elongiert wird
:
Die RNAse-H (Teil des RTs) verdaut nun Teile des originären RNA-Strangs, läßt aber einige Sequenzen über (oligo RNA: polypurinreich),
die dann als Primer
für die "Second Strand"-DNA-Synthese
dienen.
An der Primer-binding-site führt diese Synthese zum Aufbau des Long Terminal Repeats, das nun wie folgt aussieht:
Die reverse Transkription läuft im Capsid ab. Zur Integration der DNA in die Wirts-DNA muß sie nun in den Zellkern verbracht werden.
Die doppelsträngige DNA-Kopie, flankiert von diesen LTRs, wird in den Zellkern eingeschleust. Der Eintritt in den Zellkern erfordert die Abwesenheit der Kernmembran und ist daher auf aktiv sich teilende Zellen eingeschränkt. Eine Ausnahme hiervon bildet HIV, das auch sich-nicht-teilende Zellen - wenn auch weniger effektiv - infizieren kann. Diese Eigenschaft des HIV ist auf zwei redundante Mechanismen zurückzuführen. Ein Kernlokalisationssignal (nuclear localisation signal: nls) im MA-Protein wird nach Phosphorylierung im Viruspartikel von der IN erkannt. Dieser Komplex wird dann aktiv in den Kern transportiert. Beim zweiten Mechanismus ist das HIV-spezifische Vpr-Protein involviert, das durch Interaktion mit dem Gag-Protein in den Viruspartikel aufgenommen wird.
Die Integration
Einmal im Zellkern angelangt, liegt die virale DNA, flankiert von zwei identischen LTRs, als lineares Molekül vor. Der Prozeß der Integration beginnt mit der Erkennung der endständigen Nucleotide der LTRs durch IN. IN ist ein virales Enzym, das vom pol-Bereich codiert wird und als Protein im Viruskern vorhanden ist. Nach dieser Erkennung werden die beiden endständigen Nucleotide des LTRs auf jeweils einem Strang abgebaut.
Dies führt zu einem einzelsträngigen Überhang von zwei Nucleotiden an beiden Enden des linearen viralen DNA-Moleküls. Gleichzeitig schneidet IN die zelluläre DNA. Die Schnittstelle in der zellulären DNA scheint zufällig gewählt zu werden. Man beobachtet jedoch eine Bevorzugung von aktivem Chromatin und Stellen, die in der großen Rinne der DNA (major groove) liegen. Die überhängenden Enden der viralen und zellulären DNA werden durch Ligation miteinander verbunden, auch wenn die jeweiligen Basen der viralen und der zellulären DNA nicht komplementär sind. Nach der Ligation werden solche nicht-komplementären Bereiche als noch bestehende Einzelstrang-Lücken durch zelleigene Reparatursysteme instandgesetzt. Das Ergebnis ist eine integrierte virale DNA (Provirus), die um insgesamt vier Basen - zwei von jedem Ende - kürzer ist als die DNA vor der Integration, flankiert auf beiden Seiten durch idente genomische Sequenzwiederholungen (DR = direct repeats).
Das Provirus integriert immer co-linear, das heißt mit der Sequenzfolge LTR - Gene - LTR. Hierin unterscheiden sich Retroviren ganz deutlich von den meisten anderen integrierenden Viren oder der Integration von nackter DNA, die man in willkürlich permutierter Sequenzfolge im Zellgenom nach der Integration finden kann.
Der Aufbau des Retrovirusgenoms (als Provirus in der Zelle) vom 5' zum 3' Ende ist wie folgt:
LTR: long terminal repeat (U3-R-U5)
In den weiß gehaltenen Regionen können noch andere Proteine codiert
sein, je nach Retrovirus.
Die Transkription
Nach der Integration bilden die LTRs den zentralen Steuerungsbereich für die Initiation und Termination der Transkription. Retroviren tragen mindestens drei Gene: (I) das gag-Gen für virale Kernproteine, die die innere Struktur des Virus ausbilden, (II) das pol-Gen für die Reverse Transkriptase und Integrase und (III) das env-Gen für die Hüllproteine, die mit den zellulären Rezeptoren interagieren und dadurch zur Infektion führen. Die Transkription wird durch Promotoren und Verstärkerelemente, die im 5'-LTR liegen, gesteuert und läuft wie bei zellulären Genen ab. Zusätzlich codieren manche Retroviren (zum Beispiel HIV) für trans-regulierende Faktoren oder sie enthalten cis-regulierende Elemente, die die Menge und Art der transkribierten RNA beeinflussen. Sowohl Transkripte von ganzer Länge (genomische) als auch einfach oder mehrfach gespleißte subgenomische RNA werden prozessiert.
Die Translation und Verpackung
Die Gag- und Pol-Proteine werden in Form eines Polyproteinvorläufers von Transkripten genomischer Länge translatiert. Diese Vorläuferproteine werden Stück für Stück proteolytisch in die reifen Gag-Proteine (MA; CA; NC) und Pol-Proteine (RT; IN) gespalten. Dies ist ein autokatalytischer Prozeß (eine Proteasedomäne (PR) ist im Vorläuferprotein vorhanden) und führt zum Viruszusammenbau und weiter zur Knospung aus der Wirtszelle, wo die letzten Reifungsschritte ablaufen. Andere Domänen dieser Vorläufermoleküle reagieren spezifisch mit RNA genomischer Länge, die für die nächste Virusgeneration als Genom verwendet wird. Hierdurch wird sichergestellt, daß nur virale RNA und nicht zelluläre RNA in die Viruspartikel verpackt wird. Spezifische Sequenzen der genomischen viralen RNA fungieren als Verpackungssignale (psi). Mindestens ein Signal (psi) am Beginn der gag-Region, unmittelbar 3' zu der Spleißdonorstelle (SD), ist obligatorisch und gewährleistet die Verpackung der viralen genomischen RNA.
Die Env-Proteine (SU und TM) werden von gespleißter subgenomischer viraler RNA translatiert. Die Vorläuferform dieser Proteine hat die Struktur NH2-SU-TM-COOH. Dieses Vorläuferprotein trägt am aminoterminalen Ende ein Signalpeptid und wird daher in das sekretorische Membransystem der Wirtszelle eingeschleust. Im Lauf der Passage durch dieses System erfolgen als Modifizierung mehrere Glycosylierungsschritte. Zelluläre Proteasen spalten das Vorläuferprotein in die reifen SU- und TM-Proteine. Über Disulfidbrücken bleiben beide Proteine miteinander verbunden und werden am Ende in die Wirtszellmembran integriert.
Die Knospung und Reifung
Die letzten Schritte des Zusammenbaus und der Freisetzung der neugebildeten Virionen erfolgen an der Zellmembran. Die Interaktion zwischen den NC-Proteinen und der viralen genomischen RNA mit dem Verpackungssignal führt zur Assoziation von zwei viralen genomischen RNA-Molekülen mit Gag-Proteinen und somit zur Bildung der neuen Viruskerne (Cores). Desweiteren enthält der Core auch die RT- und IN-Enzyme sowie die tRNA-Primer, die für die Initiation der reversen Transkription erforderlich sind. Der Core bildet sich an der Zellmembran, wo die Konzentration von inserierten viralen Env-Proteinen am höchsten ist. Durch Knospung werden die neuen Virionen freigesetzt. Diese Viruspartikel durchlaufen noch weitere Reifungsstadien, in denen Proteinspaltung, Konformationsänderungen und eine Reorganisation der viralen Proteine im Viruskern erfolgen, ehe sie als völlig ausgereifte infektiöse Viren vorliegen. Während der gesamten Prozesse der retroviralen Infektion und Virusproduktion (zumindest gilt dies für MLV) wird die virusproduzierenden Zelle in keiner Weise geschädigt.
Die komplexeren Retroviren, wie HIV, besitzen noch Regulationsmechanismen und die dazugehörigen Proteine, die aus doppeltgespleißter RNA synthetisiert werden.
Da Retroviren häufig zu Zellentartung bzw. Fehlsteuerungen führen, wird die zugrundeliegende genpathologische Komponente eigens besprochen.
For further information
http://www.microbiologybytes.com/virology/Retroviruses.html