Virologische Nachweismethoden                     Back to Allgemeine Virologie

Im Laufe der Viruserforschung ergaben sich mehr und mehr Techniken und Ansätze diese Erreger "nachzuweisen".

Unter den heutigen technischen Vorraussetzungen ist es daher umso wichtiger die "richtige" Frage zu einer Probe (oder einem Problem) zu stellen, da der Nachweis von Virusaktivität,  genomischen Materials, Antigen oder Antikörpern jeweils andere Interpretationen einer Krankheitssituation zuläßt.

Grundsätzlich kann man Viren von 2 Seiten aus betrachten:

• Direkt:    Isolierung und Darstellung des Virus per se
• Indirekt:  Reaktion des Wirts auf einen Kontakt mit dem Erreger

Isolierung und Darstellung des Virus

Viren sind normalerweise zu klein, um sie mit etwas anderen Methoden als dem Elektronenmikroskop darzustellen (Ausnahme Pockenviren). Aber selbst für ELMI Untersuchungen benötigt man größere Mengen Virus (10¹¹) wenn sie nicht morphologisch ganz spektakulär sind.

Das Elektronenmikroskop und auch die Röntgen-Kristallographie haben viel zur Strukturanalyse der Viren beigetragen, sind aber äußerst aufwendige Techniken, die meist auch nur nach einer Multiplikation der Viren in Kultur zum Ziel führen. 

Daher braucht man Vermehrungsverfahren, die, anders als bei Bakterien, neben dem "Futter" auch noch "Arbeitskraft" zu Verfügung stellten- das Virus braucht eine Wirtszelle, oder wie bei der Computer-diskette: Nix geht ohne Computer.

Also ein Wirtssystem ist nötig

Die Wahl des Kultursystems ist vom Versuchsansatz abhängig, wenn es überhaupt schon ein Kulturverfahren gibt. Viele Viren gelten heute noch als nichtkultivierbar, man denke nur an intestinale Erreger. Molekulare Techniken haben hier eine wesentliche, alternative Rolle übernommen.

Nachweis in einem experimentellen Wirt.  Eins der ältesten Nachweisverfahren war die Applikation "infektiösen Materials" eines Erkrankten in einen empfänglichen Wirt und die Beobachtung der Entwicklung von Symptomen.

Versuchstiersysteme werden auch heute noch in der Virologie eingesetzt um

• Virus zu propagieren, das auf keinem künstlichen Kultursystem angeht
• die Pathogenese eines bestimmten Virus klarzustellen
• Impfstoffe auf Ihre Sicherheit und Verträglichkeit zu testen.

Probleme dabei sind

• der hohe Preis der Versuchstierhaltung
• komplexe Versuchstiersysteme machen die Forschung ebenfalls schwierig
• Variationen beim Wirt führen oft zu nichtvorhersehbaren Ergebnissen
• unter ethischen Grundsätzen ist mancher Versuchstiereinsatz moralisch nicht zu rechtfertigen
• Überholtheit mancher Ansätze durch moderne Techniken   

Heute sind Versuchstiere meistens von "in vitro"  Zellkulturen abgelöst.

Nihilotrotzquam wird man bei Untersuchungen komplexer Interaktionen wohl in absehbarer Zeit nicht ganz auf sie verzichten können.

Fertile Bruteier werden auch seit langer Zeit benutzt.  Diese Methode eignet sich vorzüglich zur Isolation und Kultivierung verschiedenster Viren, z.B. Pocken.  (Anatomie des Bruteis)

Da sich Kücken in 21 Tagen im Ei entwickeln und man normalerweise Veränderungen in der Morphogenese der Küken erwartet, wird die Injektion des Testmaterials zwischen 6. und 12 Bruttag vorgenommen. Bis zum 5. Tag spielt der Inoculationsort keine Rolle. Später wird Kompartment-spezifisch injiziert.

Allantoishöhle	10 - 11 Tage vorbebrütet	Ernte großer Menge an virushaltiger Flüssigkeit
Amnionhöhle	8 - 11 Tage vorbebrütet	für Isolation von Ortomyxo- und Paramyxoviren
Dottersack	6 - 8 Tage vorbebrütet	für Rikettsien und Chlamydien
ChorioAllantois- Membran	10-12 Tage vorbebrütet	Pocken, Herpes, Toga (Tollwut)
Exembryonierte Hühnereier	16 Tage alter Embrio mit Dottersack u. Eiweiß	Kultivierung von Influenza

Für Pocken, Ortho- und Paramyxoviren verwendet man Bruteier häufig.

Organkulturen

Sie werden wegen ihrer hohen technischen Ansprüche nicht häufig verwendet.

Sie bieten aber den Vorteil, daß es sich fast nur um ausdifferentierte Zellen handelt und so neben der Replikation auch die pathologischen Veränderungen gezeigt werden können .

z.B.  Tracheal-Epithel-Kultur:  Zilientragende Epithelien schlagen auch in Kultur synchron. Bei Infektion kommt es jedoch zu Asynchronie und Zelltod.

Primäre Zellkulturen können von Organen oder sonstigen Zellen (Fibroblasten, Lymphozythen) kultiviert werden.

Logischerweise sollten sie von einem empfänglichen Wirtstier stammen und dem Zelltyp entsprechen, der vom Erreger für die Replikation normalerweise benützt wird. Es gibt aber auch Beispiele heterologer Kulturen, die leicht infizierbar sind (z.B. exembryonierte Hühnereier für Influenza).

Häufig wächst ein Virus nur sehr langsam in seinem neuen Enviroment an, bis er sich durch Mutationen der Kultur angepasst hat, und "normal" weiterwächst.

Vorbedingung ist, daß man eine Nährflüssigkeit (Medium) für die gewünschte Zellart besitzt, die ein Leben in Kultur ermöglicht und daß die Suspension keimfrei aufbewahrt werden kann.

Zelllinien

Mit der Erfindung der Antibiotika konnte man, mehr oder weniger zum ersten Mal, routinemäßig Zellen in Kultur halten. Ein Medium aus Salzen in isotonischer Lösung mit Zusatz foetalen Kälberserums (FCS), das Proteine und Wachstumsfaktoren beinhaltet, sorgt für die Erhaltung bzw. Vermehrung der Zellen. Wenn das Medium ausgelaugt ist, muß es ersetzt werden, was oft gleichzeitig mit dem Aufteilen der sich neu entwickelten Zellen durchgeführt wird (passagieren) da es ein optimales Verhältnis für Zellen/Oberfläche oder Volumen gibt .

Grundsätzlich können Zellen sich auf Oberflächen festsitzend oder in Suspension vermehren. So werden sie je nachdem durch Zentrifugieren oder Ablösen und Verdünnen für die nächste Passage eingestellt.

In der industriellen Produktion von Impfstoffen, Antigenen oder sonstigen Zellprodukten werden andere Methoden verwendet. Rollerflask's, Flaschen mit Belüftung oder auch konstantem Medienzufluß für Zellen in Suspension,   großoberflächige Einsätze oder Micro-carrier (Kleinstpartikel, die von Zellen besiedelt werden, aber in Suspension bleiben) stellen für adhärente Zellinien häufig genutzte Methoden dar.

Primärzellinien  versus  Permanent-Zellinien

Primärzellinien werden aus Gewebe gewonnen, sind also diploid, und teilen sich unter günstigen Bedingungen 10 -100 Mal. Dann kommen sie in die "Krise", da sie sich verändert  haben  (Hayflick's Rule) und sterben ab. Einige der Zellen können aber genetische Veränderungen (Mutationen) durchgemacht haben (Aktivierung immortalisierender Gene, Heteroploidie) so daß sie unsterblich werden und als Zellinien weiter wachsen.

Reaktion des Wirts auf einen Kontakt mit dem Erreger

Ähnlich wie bei Versuchtieren oder dem Brutei, bei denen Erreger nach Infektion zu spezifischen pathologischen Veränderungen führen, kann auch in der Zellkultur ein Virus durch spezifische morphologische Veränderungen nachgewiesen werden.

Dies ist aber nicht zwangsläufig der Fall, also ergeben sich 3 Möglichkeiten:

• mancher Virus kann sich in Zellen vermehren, ohne die Zelle sichtbar zu stören
• Proliferation / Transformation der Zellen mit oder ohne Virusvermehrung
    - erhöhte Teilungsrate der Zellen,  (Auszählen)
    - erhöhter Mitoseindex (durch spezifische Markierung z.B. mit radioaktiv markiertem Thymidin)
    - erhöhte Metabolismusaktivität  (metabolic rate MTT)
    - transformierte Zelle verlieren die Kontaktihibition und formen Zellhaufen (foci)
    - transformierte Zellen verlieren ihre Kontakinhibition und wachsen in weichem Agar
    - transformierte Zellen können Tumoren in nackten Mäusen erzeugen
• Virusvermehrung mit klarem cytopathischen Effekt (CPE)
    wobei der Typ der CPE, und das zeitliche Auftreten p.i. ungefähr die Klasse des Virus angibt:
  

Serologie und molekulare Techniken

Neben den  nur mit lebenden Viren funktionierenden Testansätzen, haben die Serologie, die Immunstimmulierung der zellulären Anwehr, die Histochemie und die Immunhistochemie viele neue Untersuchungsmöglichkeiten bereit gestellt .

Die traditionellen Methoden sind in den letzten Jahren um immer raffiniertere Techniken erweitert  worden:

• Virale Antigene können mit serologischen Techniken unter Einsatz von mono- und polyklonalen Antikörpern nachgewiesen werden.
• Antikörper gegen virale Antigene im Serum können durch gereinigte oder synthetisierte Antigene spezifisch nachgewiesen werden
• Dabei kommen Techniken wie Präzipitation, Agglutination, Immunofluoreszens, ELISA in all seinen Varianten, Complement-Fixation und nur noch selten Radio-Immuno-Assays zum Einsatz.

Molekulare Techniken der Proteinchemie und der Nucleinsäure-biochemie haben das Spektrum der Methoden noch erweitert

• Polyacrylamid Gel-Elektrophorese  (PAGE) zur Auftrennung von Proteinfragmenten
• Western Blot, der Nachweis aufgetrennter und auf Nitrocellulose gebundener Proteine mittels spezifischer Antikörper und der enzymatischer Färbung
• Polymerase Chain Reaction (PCR) , Vermehrung spezifischer Segmente viraler Nucleinsäuren mittels spezifischer Primer
• Southern Blot, die Hybridisierung von DNA und Nachweis mittels markierter Sequenzen
• Sequenzanalyse von Teilen des viralen Genoms
• Analyse des Längenpolymorphismus von mit Restriktionsenzymen gespalter viraler Nukleinsäure

Durch deren Anwendung konnte einige Erreger zum ersten Mal identifiziert werden.

Hepatitis C ist ein klassisches Beispiel. Der Erreger konnte nie kultiviert werden, nur Teile seines Genoms waren von infizierten Patienten isoliert worden. Die Gentechnik konnte schließlich das komplette Genom rekonstruieren. Dies ermöglichte die Synthese von viralen Peptiden, die dann als Antigene in diagnostische Tests eingebaut wurden. Heute gibt es kommerzielle ELISA's für Hep. C chronisch Infizierte und zum Screening von Blutspenden.

Weiters können diese Techniken auch im noch relativ neuen Gebiet der genetischen Epidemiologie eingesetzt werden. Da Viren bei ihren Streifzügen durch die Populationen genetisch immer wieder adaptieren bzw. mutieren kann mit diesen Methoden deren Wanderungsbewegung nachvollzogen werden.