Komplement-Bindungsreaktionen                         Back to Allgemeine Virologie

CFT

Aktivierung der Komplement-Kaskade

Die Aktivierung der klassischen Komplement-Kaskade durch Antikörper führt zur Ausbildung des Membran attakierenden Komplexes (MAC), welcher Zellmembranen zerstört. Wenn der Antikörper an Erythrozyten gebunden ist, werden also diese lysiert. Wird das Komplement aber in einer Ag / Ab-Reaktion gebunden, steht  es für die Lyse nicht mehr zu Verfügung.

Komplement bindende Ab's  erscheinen in höheren Titerwerten nur bei akuter oder persisterierender-reaktivierter Infektion -daher nur verwenden zur Abklärung einer relativ frischen Infektion.

Komplement bindende Ab's sinken rapide (innerhalb Monaten) nach der Infektion auf nicht messbare Mengen. (Ausnahmen: HSV, CMV, EBV)

Sehr komplizierter Test, da viele biologische Materialien aufeinander abgestimmt werden müssen.

Gewöhnlich wird das ganze Virus als Ag verwendet, manchmal auch gereinigte Strukturproteine (jedoch können manchmal Kreuzreaktionen zwischen Komponenten von verschiedenen Viren entstehen, z.B. zwischen V (Hülle) und S (Kern) Proteinen von Paramyxo, Mumps und Parainfluenza Viren)

Zweistufiger Prozeß

• (1) Ab/Ag Bindung
• (2) Hämolytische Messung

Hämolyse :          (negativ KBR) Komplement wurde nicht gebunden.

Keine Hämolyse: (positive KBR)

Ag/Ak-Bindung

• Verdünnungsreihen von Patientenserum
                Komplement im Patientenserum muß erst ausgeschalten werden. Daher das Serum 30 Minuten bei 56 °C inkubieren.
• eine fixe Menge von Meerschweinchenserum zugeben (mit einer fixen Menge an Komplement)
• Inkubation mit einer fixen Menge von viralen Antigenen.

Enthält das Serum den entspechenden Ab der Klassen IgG1, IgG3, und evenuell IgM (klappt nicht immer), kann die Komplement-Komponente C1q (mit sechs Liganden-Positionen) eine der zwei CH2-Regionen der Fc-Domäne von zwei Abs binden und so 2 Antikörper verbinden.

Wenn genug spezifischer Antikörper im Patientenserum vorliegt, ist das Komplement aus dem Meerschweinchenserum aufgebraucht.
- diese Reaktion benötigt Mg oder Ca-Ionen

Hämolyse-Messung

- Indikatorzellen sind Erythrozyten vom Schaf und anti-Schaf-RBC(Ery) Antikörper (von Kaninchen)

• Kaninchen werden mit Schaf RBCs infiziert und produzieren Abs gegen RBC- Oberflächenproteine

- Komplement, das nach der ersten Bindungsreaktion noch vorhanden ist, kann nun anti-Schaf Ery-Ab's und Ery's verbinden und Hämolyse verursachen.

- daher zeigt Lyse die Gegenwart von Komplement und daher das Fehlen von spezifischem Ab in dem getestetem Patientenserum (negative KBR)

- Keine Lyse heißt, daß das ganze Komplement durch die Ab in dem Patientenserum aufgebraucht wurde und gibt daher positive KBR (Virus wurde durch die Ab- Produktion beim Patienten bestimmt) => Knopfbildung

- der KBR Titer wird bei der höchsten Verdünnung des Patientenserums gemessen, die zu einer < 50 %igen Lysis führt

- der Wert für 50 % wird vom Durchmesser des Erythrozyten Sediments bestimmt

• Reduktion des Durchmessers des Sediments um 50 %, heißt mehr als 50 % Lysis.

Hämolyse in Gel

Zur Messung von spät auftretenden, hoch affinen IgG Ab

Negative Hämolyse im Geltest gekoppelt mit einer positiven Hämagglutination Inhibitions Test weist auf eine sehr neue Infektion hin

Erythrozyten werden sensibilisiert mit spezifischen Antigen eines Virus (z.B. Hammel-RBCs werden sensibilisiert mit Rötelantigen.)

- diese Ery's werden in eine 1 % Agarose gemischt, und ein 1,5 mm dickes Gel gegossen

-Löcher (3 mm Durchschnitt) werden in das Gel gestochen

- 5 µl durch Hitze inaktiviertes Patientenserum wird in die Löcher pipettiert

- nach 20 Stunden Diffusionszeit sollte jeder spezifische Ab in dem Patientenserum mit den Ags auf dem RBCs reagiert haben.

- Platten werden mit Meerschweinchenserum überschichtet, das Komplement enthält.

- die Ery's, die einen Ab/Ag-Komplex aus dem Patientenserum enthalten, werden nun durch das Komplement lysiert.

- das Ausmaß der Lyse (Durchmesser der Hämolyse um das Loch) ist proportional zur Menge der spezifischen Ab im Serum

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