Adeno Associated Virus    

Der AAV-Lebenszyklus

Adeno-assoziierte Viren (AAV) lassen sich sowohl aus Säugetieren als auch aus Vögeln isolieren. Sie gehören zur Familie der Parvoviren und werden als defekte Viren (oder abhängige Viren) angesehen, da sie für eine produktive (lytische) Infektion Helferfunktionen benötigen, die entweder von Adenoviren oder Herpesviren zur Verfügung gestellt werden. In Abwesenheit dieser Helferfunktionen in den Zielzellen wird eine Zelle zwar von AAV infiziert, ruht aber als integriertes Genom in dieser Zelle (latente Infektion).

Infektion

Der zelluläre Rezeptor für AAV ist unbekannt. In neueren Veröffentlichungen vermutet man, daß ein 150-kD- Glykoprotein am AAV-Eintritt in die Zelle beteiligt ist. Das AAV-Genom besteht im Fall von AAV-2 aus einer Einzelstrang-DNA mit einer Länge von 4680 bp mit entweder negativer oder positiver Polarität. Sie trägt am Ende eine 145 bp lange invertierte Basensequenz, wobei die ersten 125 bp eine T-Struktur bilden können.

Das 3´-Ende einer der beiden terminalen T-Strukturen dient nach Eintritt in die Zielzelle als Primer für die Synthese des neuen DNA-Stranges. Es scheint, daß der Prozeß der Synthese des zweiten Stranges von AAV der limitierende Schritt bei der AAV-Infektion ist und von Helferfunktionen, wie etwa denen des Adenovirus E4ORF6, abhängt. Vor über zehn Jahren wurde beobachtet, daß in Abwesenheit der Helferfunktionen die AAV-Replikation zu einem geringen Maß durch eine Behandlung der AAV-infizierten Zellen mit mutagenen Substanzen oder durch Zellzyklussynchronisation stimuliert werden konnte. Man nimmt an, daß diese Behandlungen einen ähnlichen Effekt auf die Synthese des zweiten DNA-Stranges hervorrufen wie Adenovirus E4ORF6. Man kann sogar die Vermutung anstellen, daß in Abwesenheit der Helferfunktionen, wie es bei hochgereinigten AAV-Vektorpräparationen der Fall ist (siehe unten), AAV in seinem Infektionsspektrum auf Zellen limitiert sein könnte, bei denen es einen besonders aktiven zellulären DNA-Reparaturmechanismus gibt.

Nach der Initiation der Synthese des zweiten DNA-Stranges an einer terminalen T-Struktur wird die zweite T-Struktur (diejenige, die nicht als Primer diente) in ihre lineare Konformation zurückgefaltet, damit der DNA-Strang bis zum Ende der Matrize synthetisiert werden kann. Hierbei entsteht eine intermediäre Struktur, in der das ursprünglich einzelsträngige virale Genom an einen noch unvollständig synthetisierten Gegenstrang gebunden ist. Um den Syntheseprozeß zu vervollständigen, schneidet ein durch das AAV-rep-Gen (entweder Rep 68 oder Rep78) codierte Protein (Endonuclease) die ursprüngliche AAV-DNA an einer Stelle, die als trs (terminal resolution site) bezeichnet wird und am gegenüberliegenden Strang des geprimten Endes der DNA liegt. Rep-Proteine sind möglicherweise als vorgeformte Proteine im Virion vorhanden. Es könnte aber auch sein, daß das Rep-Protein bald nach Eintritt in die infizierte Zelle synthetisiert wird.

Rep bleibt an die DNA geheftet und die Replikation wird bis zum Ende der Matrize weitergeführt. Zu diesem Zeitpunkt liegen das Original und die Kopie des einzelsträngigen Genoms in doppelsträngiger linearer Form vor. Es ist interessant, daß als Ergebnis dieses Prozesses jeder Strang teils als parentales, teils als neusynthetisiertes Molekül vorliegt.

Wird der lytische Zyklus - in Gegenwart der Helferfunktionen - eingeschlagen, so wird die doppelsträngige Form des Genoms benutzt, um zwei einzelsträngige Kopien mit negativer und positiver Polarität zur Verfügung zu stellen. Beide Stränge können in Virionen verpackt werden.

Integration

Für die Integration der doppelsträngigen DNA-Form in die genomische DNA im Zuge der latenten Infektion vermutet man folgenden Ablauf: ein zweites Rep-Molekül bindet an die zelluläre DNA und zwar vorzugsweise an einer 110 bp-Sequenz, die als P1 bezeichnet wird und auf dem menschlichen Chromosom 19q13.3-qter liegt. Ein Grund für die bevorzugte Bindung des Rep an P1 könnte die darin enthaltene Sequenz (GCTC)3-4 sein, die ebenfalls in der AAV-ITR identifiziert ist. Diese Sequenz allein ist jedoch für die Bindung nicht ausreichend. Es wurde zusätzlich ein konserviertes trs, acht oder zwölf Nucleotide entfernt von der Bindungssequenz auf der zellulären DNA gefunden, an welches Rep einen Einzelstrangschnitt setzt. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Kombination der (GCTC)3-4-Sequenz und der trs-Sequenz auftritt, ist geringer als 6x10^-11. Dies würde das auf Chromosom 19 eingeschränkte Auftreten der Integrationsstelle erklären. Die direkte oder indirekte Interaktion zwischen dem Rep-Protein, das an das doppelsträngige lineare AAV-Genom gebunden ist, und dem Rep-Protein, das an die geschnittene P1-Stelle bindet führt zur Erzeugung eines nicht-homologen Rekombinationspunktes und erlaubt damit die Integration des AAV-Genoms in die genomische DNA.

Da man oft eine Verdopplung oder Amplifikation zellulärer Sequenzen um die Integrationsstelle beobachten kann, ist vermutlich ein aktiver Replikationsprozeß bei der Integration involviert, und es genügt nicht nur ein einfacher Strangbruch-Reparaturmechanismus. Zellteilung ist somit für die Integration von AAV wahrscheinlich eine Voraussetzung. Dieser aktive Mechanismus führt dazu, daß unabhängig von der MOI (multiplicity of infection), die integrierten viralen Genome überwiegend in zwei bis vier Tandemkopien vorhanden sind. Ein oder zwei Kopien der invertierten repetetiven Strukturen werden zwischen mehrfachen Genomkopien gefunden. Alle Genomkopien haben identische Sequenzen, inklusiv Punktmutationen oder Deletionen, woraus zu schließen ist, daß alle Kopien von einem einzigen eingebrachten Genom stammen. Dies kann ein Ergebnis der Replikation des Genoms während des Integrationsprozesses sein.

In allen bis jetzt untersuchten Zielzelltypen integrierten ungefähr 70% der AAV-Genome in Chromosom 19. In Abwesenheit von Rep scheint die Integration zufällig stattzufinden. In Gegenwart von Rep kann auch eine Integration an anderer Stelle, jedoch zu einer sehr geringen Frequenz, stattfinden. Nach Integration im Chromosom 19- Locus ist das virale Genom im Zielzellgenom mit der Struktur ITR (inverted terminal repeat)-rep-cap-ITR vorhanden. Das virale Genom wird entweder durch eine einzige oder durch eine verdoppelte zelluläre P1- und trs-Sequenz flankiert.

Lytischer und latenter Lebenszyklus

In Zellen, die nur mit AAV infiziert wurden, können fast keine AAV-mRNA, Proteine oder Virionen nachgewiesen werden - das Virus liegt als integriertes latentes Genom vor. Die kleine Menge an Rep-Protein, die in Abwesenheit der Helfervirus vorliegt, dient zur Herunterregulierung der AAV-Promotoren.

Der lytische oder produktive AAV-Lebenszyklus hängt von der Anwesenheit der Helferfunktionen ab, das heißt von bestimmten Proteinen der Adenovirus, Herpesvirus, Cytomegalovirus oder humanen Herpesvirus-6. Die adenoviralen und teilweise die herpesviralen Proteine wurden schon identifiziert. Eine der ersten Funktionen des Adenovirus-E1A-Proteins dient dazu, die Transkription der AAV-P5- und AAV-P19-Promotoren zu aktivieren. Dies führt zu einer fünf bis 20fachen Erhöhung der Rep-Synthese. Die Rep-Proteine aktivieren dann alle drei AAV- Promotoren (P5, P19 und P40) um mindestens das 50fache. Die Aktivierung durch Rep scheint sowohl Rep-regulierbare Sequenzen, die 3´ von jedem AAV-Promotor lokalisiert sind, als auch ein redundantes regulierendes Element, das innerhalb der ITRs liegt, zu involvieren.

Zusätzlich zu E1A sind auch Adenovirus E1B- und E4-Regionen für eine effiziente AAV-Replikation erforderlich. Diese scheinen eine Akkumulation der AAV-mRNA anzuregen, während E2A und VA-RNA das Spleißen von AAV-RNA und die Translation stimuliert.

Die Festlegung, ob das AAV den lytischen, episomalen oder latenten integrierten Lebenszyklus antritt, ist zum größten Teil von der Verfügbarkeit der Helferfunktion abhängig. In Abwesenheit von Helferfunktionen zur Zeit der Infektion wird das AAV-Genom integriert und die latente Phase beginnt. Das integrierte Genom kann durch spätere Helfervirusinfektion mobilisiert werden. Dies führt zum Rep- gesteuerten Ausschneiden des AAV-Genoms durch Schneiden an trs und zur episomalen AAV-Replikation mit hoher Kopienzahl, bevor durch Zellyse Virionen freigesetzt werden.

Sind die Helferfunktionen schon zur Zeit der Infektion vorhanden, muß es nicht notwendigerweise zur Integration kommen. Vielmehr bleibt das Virus dann episomal und repliziert auf normalem lytischen Weg.

Transkription und Translation

Das virale Genom ist folgendermaßen aufgebaut: ITR - rep - cap - ITR. Während die ITRs für Replikation, Verpackung, Integration und Rescue absolut notwendig sind, werden sie für die Transkription, für die interne Promotoren zur Verfügung stehen, nicht benötigt.

Im AAV-Genom wurden drei Hauptpromotoren (P5, P19 und P40) identifiziert. Der P5-Promotor führt sowohl zu einem Transkript mit genomischer Länge (4,2 kb) als auch zu einem geringfügig kürzeren, intern gespleißten Transkript (3,8 kb). Diese Transkripte werden in die Rep 78- und Rep 68-Proteine translatiert. Dem Rep 68 können jedoch keine spezifischen Funktionen, die sich von denen des Rep 78 unterscheiden, zugeschrieben werden. Dies legt nahe, daß die gespleißte Version nur ein Nebenprodukt des Spleißens von Transkripten des P40-Promotors ist, um die Cap-Produkte zu erhalten. Der zweite Promotor von AAV (P19) führt ebenfalls zu zwei mRNAs: einer ungespleißten (3,6 kb) und einer gespleißten (3,3 kb) mRNA. Diese werden in Rep 52 und Rep 40 translatiert, wobei davon ausgegangen wird, daß Rep 40 die redundante kleinere Version des Rep 52 ist.

Die Rep-Proteine spielen eine essentielle regulatorische Rolle im Lebenszyklus von AAV. Sie regulieren die drei AAV- Promotoren, sind für Replikation, Verpackung und Integration notwendig und vermitteln die Spezifität der Integrationsstelle auf dem humanen Chromosom 19. Der P40-Promotor führt zu Transkripten, die für die drei viralen Capsidproteine codieren. Das Capsid besteht zu 80 - 90% aus Vp3 und zu jeweils ungefähr 5% aus Vp1 und Vp2.

Zusammenbau, Verpackung und Freisetzung

Die Spezifität der Einkapselung des einzelsträngigen AAV-DNA-Genoms - egal welcher Polarität - ist durch die Gegenwart der ITRs auf der DNA gegeben. Hohe Rep- Konzentrationen sind eine absolute Notwendigkeit für eine effiziente Verpackung. Es ist jedoch unwichtig, welches Rep- Protein diese Aufgabe ausführt. Die Höhepunkt des Assembly wird durch die Produktion einer großen Zahl von kleinen (20 - 24nm) ikosaedrischen nichtumhüllten Viruspartikel im Nucleus erreicht. Die physiologische Erschöpfung der Zelle aber auch die cytotoxischen Effekte des Helfer-Adenovirus oder -Herpesvirus lösen vermutlich die Zellyse aus.